El Instituto Crescenti cuenta con dos bioterios acondicionados en concordancia con las normativas internacionales para el trabajo con animales de experimentación (“Principios Directrices Internacionales para la Investigación Biomédica que Implique el Uso de Animales”, Consejo de Organizaciones Internacionales de las Ciencias Médicas (CIOMS), Ginebra, 1985, y “Guía para el cuidado y uso de animales de laboratorio”, National Research Council, Copyright National Academy Press, Washington D.C., USA, 1996 y actualizaciones hasta el 2021).
Todos los experimentos se han desarrollado bajo estrictos protocolos de investigación siguiendo las normas bioéticas internacionales actualizadas y han sido en todos los casos aprobados por del Comité de Docencia e Investigación del Instituto (CODEI) y por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio (CICUAL).
Para el trabajo experimental in vivo se emplearon distintas especies animales de acuerdo con los objetivos específicos.
En primer lugar se efectuaron los estudios de toxicidad in vivo del Complejo Antioxidante y a posteriori se efectuaron experimentos que permitieron conocer sus mecanismos de acción a distintos niveles.
A lo largo de más de 7 años se efectuaron los estudios experimentales in vivo necesarios para la determinación de posibles efectos tóxicos y/o secundarios del Complejo Antioxidante. Para ello se emplearon especies animales roedoras y no roedoras: rata (hembras y machos Wistar), ratón (hembras y machos Balb/c), conejo (New Zealand), cobayo y perro. Los animales se mantuvieron en condiciones adecuadas a lo largo del tiempo requerido para las evaluaciones bajo estrictos protocolos de investigación. Los estudios en la especie no roedora perro (Canis familiaris) se derivaron a la Facultad de Ciencias Veterinarias de la Universidad de Buenos Aires. En todas las especies los ensayos comprendieron estudios de toxicidad aguda, subaguda y crónica además de la determinación de la dosis máxima tolerable (DMT). Asimismo, se estudió la sensibilidad cutánea y la teratogénesis o capacidad de inducir malformaciones congénitas.
En los estudios de toxicidad aguda se observaron los efectos clínicos agudos y se estudió la anatomía patológica en los órganos y tejidos de todos los animales. En los experimentos de toxicidad crónica se evaluó en sucesivos lotes a lo largo del tiempo la posible alteración en la postura y la conducta, la evolución de los pesos corporales, el consumo de agua y comida, la capacidad respiratoria, el aspecto del pelaje y numerosos parámetros bioquímicos. Finalmente se efectuaron las necropsias, se determinó el peso final de los animales y se tomaron muestras de los órganos, particularmente de hígado, riñón, pulmones, corazón, bazo, gónadas, útero. Los animales que recibieron a largo plazo el Complejo Antioxidante presentaron siempre un excelente estado general, vivacidad en sus movimientos y pelaje brillante.
Se concluyó finalmente que el Complejo Antioxidante claramente no presenta efectos tóxicos de ninguna índole aun a dosis mucho mayores (10000 veces mayores) a las utilizadas habitualmente, demostrándose así que su administración es totalmente atóxica y carente de efectos secundarios.
Una vez probada la total falta de toxicidad y de efectos secundarios por parte del Complejo, se estudiaron sus efectos en distintos modelos experimentales in vivo. Para ello se usaron modelos previamente reportados y reconocidos por la comunidad científica internacional.
A partir de los resultados in vitro, se planteó la hipótesis de estudiar los efectos inducidos por el Complejo Antioxidante sobre el sistema inmunológico en animales. Trabajando con linfocitos provenientes de ganglios linfáticos de ratones que recibieron in vivo el Complejo Antioxidante, se evaluó la actividad y funcionalidad de los linfocitos T de estos ratones en comparación con los que no lo recibieron. Se comprobó que la proliferación de los linfocitos T de los animales que recibieron el Complejo Antioxidante fue significativamente más alta. Asimismo, la producción de determinadas citoquinas como interferón gamma (lFNγ), relacionada con la activación de las células T y la defensa antitumoral, y la interleuquina seis (IL-6), relacionada con la promoción de una adecuada respuesta inmune, fue significativamente mayor en los animales que recibieron el Complejo Antioxidante en relación con los que no lo recibieron.
Entre las enfermedades que involucran al sistema inmune se destaca la esclerodermia, afección crónica esclerosante de la piel caracterizada por presentar fibrosis y engrosamiento de la piel, estructuras subyacentes (grasa y músculos), vasos sanguíneos y órganos internos como esófago, pulmón y otros. Cuando el tejido normal de un órgano es reemplazado por tejido fibroso, dicho órgano deja de funcionar adecuadamente. Si bien se la considera una enfermedad autoinmune, actualmente se sabe que también está involucrado el equilibrio oxidativo del organismo. Es una enfermedad que altera fuertemente la calidad de vida de los pacientes, de difícil diagnóstico y tratamiento. Entre otras manifestaciones clínicas, los pacientes pueden presentar una importante disminución de peso debido a la reducción de la luz del esófago por la fibrosis, lo que dificulta el pasaje de los alimentos.
En base a los efectos sobre el sistema inmune y las enzimas antioxidantes demostrados para el Complejo Antioxidante, el laboratorio se propuso evaluar los resultados de su administración en ratones Balb/c y C3H con esclerodermia inducida experimentalmente mediante inyección de bleomicina. Se observó que los animales inyectados con bleomicina presentaron fibrosis cutánea con marcada sobreexpresión de colágeno, expresión de anticuerpos antinucleares en piel, esófago y pulmón, y afección histológica de órganos internos. Asimismo, se detectaron elementos representativos del estrés oxidativo en las células de la epidermis y de la dermis. Particularmente en el esófago se evidenció un significativo estrechamiento de la luz interna como consecuencia del engrosamiento de la mucosa, concordante con la significativa disminución de peso que mostraron estos animales respecto a controles sanos. De acuerdo con lo esperado, los ratones inyectados con bleomicina que recibieron el Complejo Antioxidante presentaron características prácticamente normales en todos los parámetros analizados.
Se trabajó con diferentes modelos experimentales, algunos inducidos experimentalmente mediante administración de cancerígenos químicos:
• Tumores mamarios cuyo desarrollo se indujo en ratas hembra Sprague-Dawley mediante la administración del carcinógeno químico N-Nitroso-N-Metilurea (NMU).
• Tumores de colon inducidos en ratas macho Wistar mediante la administración del carcinógeno químico 1,2-dimetilhidrazina (DMH).
• Tumores de colon inducidos en ratones macho Balb/c mediante la administración del carcinógeno químico 1,2-dimetilhidrazina (DMH).
Otros inducidos por inóculo de células transformadas:
• Tumores desarrollados a partir de la inoculación de células tumorales humanas en ratones nude o desnudos, los que por carecer de timo y ser inmunoincompetentes, requieren condiciones especiales para su supervivencia y adecuado control de los experimentos. A su vez esa condición, les permite no rechazar el xenotarnsplante de células tumorales humanas.
• Tumores desarrollados en ratones Balb/c por inoculo de células 4T1.
Se utilizaron para los inóculos las líneas celulares: MDA-MB-231 derivada de carcinoma mamario, PANC-1 y BxPC3 provenientes de tumores pancreáticos humanos, WM-35 y M1-15 derivadas de melanomas, entre otras (ver Estudios experimentales in vitro).
La elección de los modelos tumorales con los que se efectuaron estos experimentos se basó en la importancia que tienen los respectivos cánceres humanos ya sea por su alta incidencia, como el cáncer de mama y el cáncer de colon, o bien por su difícil tratamiento con terapias convencionales, como el cáncer de páncreas y el melanoma.
Todos los modelos in vivo analizados mostraron como denominador común un muy buen estado clínico de los animales que recibieron el Complejo Antioxidante, con incremento de su peso y vivacidad así como un aumento en la sobrevida con respecto a los que no recibieron el Complejo.
En todos estos modelos tumorales se estudió el efecto del Complejo Antioxidante en la evolución tumoral, diferenciación, vascularización, apoptosis, expresión de enzimas antioxidantes, respuesta inmune y otros efectos.
También se estudió la posible acción preventiva del Complejo Antioxidante en los modelos tumorales: de mama obtenido en ratas hembra mediante inyección de NMU, y de colon en ratas macho por inyección de DMH.
Los resultados mostraron que:
• Las ratas hembra inyectadas con el carcinógeno NMU desarrollaron tumores mamarios con características similares a las del cáncer mamario humano, como la expresión de receptores a estradiol y progesterona y la respuesta al tratamiento antihormonal. Las ratas a las que se les administró el Complejo Antioxidante desde la aparición del primer nódulo palpable, presentaron una disminución del tamaño tumoral y una sobrevida significativamente mayor a las que no lo recibieron.
Asimismo, los tumores desarrollados en las ratas que recibieron el Complejo Antioxidante desde antes de la inyección del carcinógeno, es decir, en forma preventiva, presentaron un mayor período de latencia y se desarrollaron en un número significativamente menor que en los animales que no recibieron el tratamiento. Los animales tuvieron una sobrevida similar a la de las ratas normales que nunca fueron inyectadas con NMU.
• El modelo de cáncer de colon utilizado es considerado como el paradigma de la carcinogénesis. El desarrollo de este cáncer es un proceso en etapas que se inicia con una displasia, traducida luego en el crecimiento de un pólipo de características benignas que luego se transforma en maligno. Finalmente, el tumor primario se disemina formando metástasis en otros órganos. Los animales inyectados con el carcinógeno DMH que recibieron el Complejo Antioxidante, desarrollaron mayoritariamente pólipos benignos y muy escasos carcinomas malignos, en un tiempo significativamente mayor que aquellos que no lo recibieron. Cuando las ratas recibieron el Complejo antes de la inyección de la DMH, es decir, de manera preventiva, el desarrollo de pólipos presentó un mayor período de latencia y fueron además, mayoritariamente benignos.
• El modelo de tumor mamario desarrollado mediante inóculo de células MDA-MB-231 provenientes de tumor humano triple negativo (de alta agresividad) mostró un crecimiento más lento y un patrón de mayor grado de diferenciación en aquellos animales que recibieron el Complejo Antioxidante con respecto a los que no lo hicieron. También se observó una importante infiltración de macrófagos, un mayor grado de muerte celular, una menor vascularización intratumoral y un menor número de focos metastásicos pulmonares.
• Los ratones Balb/c en los que se inoculó las células 4T1 y fueron tratados con el Complejo Antioxidante, tuvieron una sobrevida significativamente mayor que los que no recibieron el Complejo.
Como es sabido, la MEC es una red tridimensional esencial tanto para células normales como malignas al intervenir en la regulación de los procesos de multiplicación celular, angiogénesis, comunicación intercelular e inmunidad.
El balance de los componentes de la MEC es fundamental en la evolución de los procesos patológicos, tanto en enfermedades autoinmunes como en el cáncer.
A partir de los resultados in vitro en líneas celulares y de las observaciones microscópicas en tumores experimentales, se decidió estudiar el posible rol de la MEC en los mecanismos regulatorios de la diferenciación, crecimiento y metástasis de los modelos empleados en el laboratorio.
Recientemente, el Comité de Nomenclatura Sobre Muerte Celular (NCCD, The Nomenclature Committee on Cell Death), concluyó que: "Curiosamente, algunas células que muestran características bioquímicas y morfológicas asociadas con la fase final de la muerte celular regulada (MCR), pueden recuperarse por medio de un proceso llamado 'anastasis', que significa "resucitar a la vida". Este mecanismo podría explicar algunas recaídas post-tratamiento en las enfermedades oncológicas. Estas investigaciones sugieren que el punto de no retorno en los procesos que conducen a la MCR tienen un grado de dependencia con el microambiente celular, la MEC.
Los resultados obtenidos en los modelos experimentales utilizados en este laboratorio demuestran claramente que el Complejo Antioxidante inhibe el desarrollo tumoral también por acción sobre el balance de la MEC.
La quimio y la radioterapia son tratamientos frecuentemente empleados en pacientes oncológicos, acompañando en muchos casos a la cirugía. Sin embargo, sus acciones no son específicas y se manifiestan también sobre los tejidos sanos, causando efectos colaterales adversos.
En el laboratorio de investigación se llevaron a cabo estudios in vivo en roedores sanos irradiando tejidos normales, particularmente los más radiosensibles como médula ósea, glándula submaxilar, intestino delgado y gónadas. Los resultados mostraron que la administración del Complejo Antioxidante se manifiesta en una acción protectora a los efectos adversos de la radiación ionizante provocada por los radicales libres, como la muerte celular, la destrucción de criptas intestinales, del epitelio germinal de los testículos y del epitelio de las glándulas salivales submaxilares. Es decir que esta protección se traduce en la conservación de la integridad y la funcionalidad de los tejidos normales.
Por otro lado, se evaluaron los efectos de la combinación del Complejo Antioxidante con un quimioterápico como la gemcitabina en ratones portadores de tumores pancreáticos. La gemcitabina es una droga que se utiliza en pacientes humanos con cáncer de páncreas como adyuvante luego de la cirugía a fin de prevenir la reaparición del tumor, o bien como tratamiento de primera línea en casos de enfermedad localmente avanzada o metastásica. La administración de esta droga presenta una serie de efectos secundarios. Uno de los más importantes es la reducción de la cantidad de células circulantes involucradas en la inmunidad. Un resultado muy importante obtenido en el laboratorio al administrar el Complejo Antioxidante junto con la gemcitabina en animales portadores de tumores pancreáticos, fue la observación de una protección significativa de la médula ósea (tejido que genera las células con capacidad inmunológica) frente al efecto tóxico del quimioterápico. Además, el Complejo Antioxidante ejerció una notable protección de las gónadas al impedir la atrofia testicular.
En resumen, en base a los resultados experimentales obtenidos in vitro e in vivo, se ha demostrado que el Complejo Antioxidante es atóxico a las dosis utilizadas y posee múltiples blancos de acción a través de los cuales:
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